重点包含大鼠缺血性脑卒中模型实验单元与大鼠慢性脑缺血模型实验单元。

　　一、大鼠缺血性脑卒中模型实验

1、动物模型：采用线栓法建立大鼠脑卒中动物模型，即大鼠大脑中动脉阻塞模型( MCAO模型)。雄性SD大鼠，10% 水合氯醛溶液40 mg /kg腹腔注射麻醉。大鼠仰卧位固定，于颈部正中线处做一2.0～2.5 cm 的纵形切口，用组织镊钝剥离皮下肌肉，暴露右侧颈动脉三角，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离右侧颈总动脉( CCA) 、颈外动脉( ECA) 和颈内动脉( ICA) 。然后在近心端结扎 CCA、ECA，用小动脉夹暂时夹闭 CCA 远心端近分叉部，然后在 CCA 近心端距分叉部4 mm处剪一小口，将带有石蜡头的栓线插入到 CCA，轻推栓线达分叉处，松开小动脉夹，从血管分叉处进入 ICA，计算从分叉处进线的距离，当插入深度在18 mm时于 CCA 远心端用细线结扎，用蘸有碘伏的医用棉签对内部进行消毒，然后缝合伤口消毒。术后灯照2 h观察，2 h 后将栓线拔出约1 cm，行再灌注。假手术组操作同正常操作，只是不插入鱼线，其余步骤同其他组。应用 Zea-Longa 五分制评分法对大鼠进行评分，符合者纳入模型成功标准。

2、评价方法：

（1）神经功能评分（Neurological Deficit Scores，NDS）：采用Zea-Longa评分法，0分为无神经系统功能缺失，活动正常；1分为不能完全伸展对侧前爪者；2分为爬行时出现向左侧转圈者；3分为行走时向偏瘫侧倾倒者；4分为不能自发行走，有意识障碍者；在规定时间点由协作者盲法评分。

（2）脑梗死面积：用4℃生理盐水灌流，取出脑组织，冠状横切约七片2mm之切片。将切片浸泡于2%的2，3，5氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）溶液染色。以图像分析软件计算TTC染色后呈现白色部位（此为中风梗塞部位）占脑半球之百分比。

（3）血脑屏障通透性：每只大鼠死亡前3小时，从右侧股静脉给予的0.5ml的6%伊文思蓝水溶液。4℃生理盐水脑组织灌流，取出左、右两侧大脑皮质放入微量试管中，用小剪将组织剪碎并捣烂。每管再加入100%三氯醋酸（trichroloaceticacid，TCA），混合均匀室温下反应1小时。以12000g转速离心5分钟后，吸取200ul上清液，利用紫外分光光度计测定吸光值。伊文思蓝脑组织渗入量越高表示血脑屏障破坏越多。

（4）脑血流检测：采用激光散斑仪检测大鼠脑组织血流。

（5）组织病理学检测：采用HE染色和尼氏染色检测脑组织病理改变。

（6）超微结构：采用扫描电镜检测脑组织超微结构改变。

3、适用领域：

（1）研究目标药物（单体或复方）对缺血性脑卒中药效及作用机制。

（2）结合蛋白质组学、代谢组学、分子对接等手段明确目标药物治疗缺血性脑卒中的相关靶点并进行分子水平验证。

（3）结合化学成分分析，对现有药物组成及配比进行优化，形成新的组分配伍药物。

4、前期研究数据：

5、研究成果：

（1）课题：

①北京市自然科学基金项目：基于脑微血管“分子开关”KLF2探讨祛风药羌活在三化汤治疗脑卒中的增效作用机理，20万。

②中医科学院医学实验中心自主选题项目：基于脑微血管调节作用的祛风药羌活在三化汤中治疗缺血性中风机理研究，45万。

（2）文章

①路颖慧，黄颖*，孙明杰等.基于HPLC和网络药理学方法的三化汤治疗脑缺血活性成分含量测定及作用靶点预测.国际中医中药杂志，2021，43（11）:1109-1115

②李雯洁,黄颖*.三化汤治疗中风的研究进展.中医研究，2021，34（12）：67-71

③李雯洁，巩子汉，黄颖*等.三化汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的保护作用，中国中医基础医学杂志，2022,28（7）:1072-1076

④巩子汉，李雯洁，孙明杰*，黄颖*.三化汤及其拆方对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究，中国实验方剂学杂志,2022,28(2):11-18

⑤苟小军，孙明杰，黄颖*等.三化汤对缺血性中风模型大鼠血清脂肪酸谱的影响，中国医院药学杂志，2022,42（3）:259-268

⑥YingHuang, Shan-shan Gao,Zi-han Gong, Wen-jie Li, Xiao-junGou*, Ji-jia Sun*,Ming-jie Sun*. Research on the mechanism of Sanhua Decoction in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology methods and experimental verification. BioMed Research International, 2022, 2022(Article ID7759402):1-20，IF= 3.411

⑦Ruisi Liu+, Shengxuan Cao+, Yufeng Cai, Mingmei Zhou*,Xiaojun Gou* and Ying Huang*. Brain and serum metabolomic studies reveal therapeutic effects of san hua decoction in rats with ischemic stroke. Frontiers in Endocrinology ,2023,14:1-14. IF=5.2.

⑧Yiming Ni+, Liangyin Cai+, Xiaojun Gou+, Wenjie Li , Mingmei ZhouI*, Ying Huang I*. Therapeutic effect of Sanhua decoction on rats with middle cerebral artery occlusion and the associated changes in gut microbiota and short-chain fatty acids. PLOS ONE,2024, 19(2): e0298148.IF=3.7

　　二、大鼠慢性脑缺血模型实验

1、动物模型：采用双侧颈总动脉结扎方法（Bilateral Common Carotid Artery Occlussion，BCCAO）建立慢性脑缺血模型。BCCAO组大鼠均采用双侧颈总动脉永久性结扎制作慢性脑缺血模型，大鼠术前称重，以1%戊巴比妥钠溶液45mg/kg体重腹腔注射麻醉。大鼠仰卧固定，备皮消毒皮肤后用于颈部正中开口，暴露胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，先沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，于镜下小心分离右侧颈总动脉(Common Carotid Artery，CCA) ，尽量不触碰神经、避免牵拉血管，分离后采用6号棉线结扎CCA。10min后采用同样手法结扎左侧颈总动脉，手术完毕后逐层缝合伤口，2%碘酊消毒伤口并注射青霉素钠溶液（60000IU/kg，i.m.）抗炎。术中全程置于电热毯上保暖，术后灯照1.5h观察，待动物完全清醒后放回饲养笼内饲养。

2、评价方法：

（1）行为学检测：采用旷场、水迷宫、新物体识别等检测大鼠学习记忆功能。

（2）核磁检测：采用核磁共振仪检测大鼠脑组织结构变化。

（3）脑血流检测：采用激光散斑仪检测大鼠脑血流变化。

（4）组织病理学：采用HE染色和尼氏染色检测大鼠脑组织病理形态学改变。

（5）超微结构：采用扫描电镜检测脑组织超微结构改变。

3、适用领域：

（1）研究目标药物（单体或复方）治疗脑组织低灌注引起的慢性脑缺血、脑小血管病、血管性痴呆等药效及作用机制。

（2）结合蛋白质组学、代谢组学、分子对接等手段明确目标药物治疗慢性脑缺血、脑小血管病、血管性痴呆的相关靶点并进行分子水平验证。

（3）结合化学成分分析，对现有药物组成及配比进行优化，形成新的组分配伍药物。

4、前期研究数据：

5、研究成果：

（1）课题：中国中医科学院自主选题项目：基于转录组学研究“祛风剂”大秦艽汤治疗脑小血管病的分子机制，28万元

（2）文章：

①Zhuo-yuanWang+, Ming-zheLi+ , Wen-jie Li +, Jing-fengOuyang, Xiao-jun Gou*,YingHuang*. Mechanismof Action of Daqinjiao Decoction in Treating Cerebral Small Vessel DiseaseExplored Using Network Pharmacology and Molecular Docking Technology. Phytomedicine, 2023,108(154538):1-14,IF=7.9

②苟小军，黄颖*，李雯洁，许晓英. 经典名方大秦艽汤的HPLC指纹图谱研究及多指标成分定量分析. 中国医院药学杂志,2023,43(5):486-493.