钙离子是心肌生理病理中最重要的第二信使之一，在心肌肥厚、心梗模型、心衰、高血压、糖尿病心肌病、心律失常、化学性心肌损伤等疾病中均发生了心肌钙转运异常，所以心肌细胞钙转运功能研究一直是上述心肌损伤的重点研究内容。

　　Ca2+介导的兴奋-收缩耦联是心肌细胞发挥正常收缩功能的关键始动环节，在心肌细胞的兴奋-收缩耦联过程中钙的转运过程如下：

　　①舒张期心肌细胞兴奋后，膜电位产生去极化，引起胞膜上的电压依赖性L-型钙通道开放（L- Ca2+ channel），胞外Ca2+内流，

　　②胞浆内钙离子浓度升高，通过以钙诱导钙释放（CICR，calcium induce calcium release）的方式引起心肌细胞内钙库（SR）在短时间内通过兰尼碱受体（RyR）向胞浆释放大量的钙，造成胞浆内钙离子浓度瞬时升高，此即为钙瞬变（Ca2+ transients）

　　③大量升高的Ca2+通过与肌丝肌钙蛋白结合进入横桥循环过程引起细胞收缩。

　　④Ca2+随后通过以下途径使细胞胞浆钙浓度降低：①SERCA2a（肌浆网钙泵）回摄入肌浆网内；②NCX（钠钙交换体）外排；③SL CaATP酶（基膜钙ATP酶）外排；④线粒体该转运体途径；

　　⑤进而Ca2+与肌丝肌钙蛋白解离引起细胞的舒张，完成一个收缩周期。

图1. 心肌细胞兴奋收缩耦联钙转运过程

　　钙转运研究涉及到心肌细胞钙瞬变、肌浆网钙库容量、钙转运蛋白功能（肌浆网钙泵、钠钙交换体，基膜钙ATP酶、线粒体钙转运体）、钙泄漏等。钙敏感性荧光染料的发明，使基于钙荧光技术进行心肌细胞钙浓度和钙瞬变成为可能。通过不同的实验方法检测钙瞬变、NCX、SERCA2a、肌浆网钙库、肌浆网钙泄漏再心肌病变的病理生理过程研究或中医药作用机理研究至关重要。

　　一、心肌细胞提取实验

　　开展心肌细胞钙转运研究的第一步是要获取高质量的心肌细胞，常用的研究对象是成年心肌细胞和乳鼠心肌细胞。成年心肌细胞与正常生理表征最为接近，常见于病理生理以及药理研究，是最常用的研究体系。但由于成年心肌细胞培养相对困难，且会产生“去分化”现象，分离后随时间会逐步丧失心肌细胞收缩功能，所以不利于进行长期药物孵育或者病毒转染的研究。而乳鼠心肌细胞可以进行长期的培养并保持收缩等生理功能，所以在进行长期药物孵育、缺氧、病毒转染等研究中常用乳鼠心肌细胞。乳鼠心肌细胞也是继成年心肌细胞最常用研究体系，保留了心肌细胞收缩和电生理等常见心肌生理表征特性。

　　提取成年大小鼠心肌细胞需要用到Langendorff离体心脏灌流装置；提取乳鼠心肌细胞需要用到组织细胞分离器。

　　1. Langendorff离体心脏灌流装置

　　生产厂商：PlexiThermo（英国），型号：S-LangC

　　为维持离体心脏的正常营养，和心肌细胞分离过程中消化酶的有效循环，实验中需建立完整的冠脉循环，提供心脏所必须的温度、氧、营养物质、消化酶。Langendorff灌流模型采用“主动脉逆行灌注法”，即经主动脉插管，灌注液通过冠脉系统，经右心室和肺动脉排出。

　　PlexiThermo生产的离体心脏灌流装置具有以下优点：

　　1) 　仪器小型化，可进行恒压灌流和横流灌流，操作简单，稳定性高，实验重复率好

　　2) 　灌流死体积少于7ml，有效节省消化酶液

　　3) 　灌流过程中可有效减少溶液气泡产生，减少消化过程中的气栓梗死，提高细胞存活率

　　4) 　体积小可置于超净台内，进行无菌消化环境，利于分离的心肌细胞进行培养

　　5) 　可扩展进行离体心脏灌流进行生理指标监测（心室内压，心电等检测）

　　我们建立了成熟稳定的急性心肌细胞分离条件，经过短期培训后即能掌握大小鼠心肌细胞分离技术，成活率高，利于进行心肌钙转运相关研究。

图2离体心脏灌流装置

　　注：A. 恒速灌流模式；B. 恒压灌流模式

图3 急性分离的大鼠心肌细胞

　　注：A. 明场光心肌细胞形态；B. 负载钙敏感性荧光染料（Fluo-4）的心肌细胞 

　　2. 全自动组织细胞分离器：

　　生产厂商：Miltenyi Biotec（美天旎，德国），型号：gentleMACS octo

　　乳鼠心肌细胞由于体积太小，不能进行与成年Langendorff一样的离体灌流。较常用的方法是剪碎组织后用胶原酶进行消化后再培养。

　　使用该设备解离组织样本时，经过预设的全自动程序，结合专业的解离试剂盒可以一键完成样本制备操作，获得单细胞悬液。可保证细胞具有尽可能高的活力以及尽量少的杂质成份，进而保证下游应用中得到可靠和可重复的结果。从而获得理想的细胞分选、分析和培养结果，保证了每一次实验结果的稳定性与可靠性。

　　本设备可以处理多种不同的组织，包括小鼠心脏、肿瘤、脾脏、肝脏、肺脏、神经组织、皮肤、肌肉组织以及人肿瘤、脐带、皮肤等组织。所获得的单细胞悬液可以应用于细胞分选、细胞培养，流式细胞分析、分子生物学分析等多种不同的后续研究应用。

图4 乳鼠心肌细胞分离与钙瞬变

　　注：左下：乳鼠心肌细胞1HZ电刺激下钙瞬变；右下：乳鼠心肌细胞自发性钙瞬变 

　　二、心肌细胞收缩与钙离子同步检测

　　依托设备：细胞内离子成像测量系统及心肌细胞收缩测定仪，生产商：IonOptix（美国），型号：HSW400

　　心脏发挥基本收缩功能的单位是心肌细胞，影响心脏泵血功能的机制研究依然是心血管领域的研究热点，包括心脏功能改变的分子基础和药物增强心肌收缩的机制等研究。对心室肌细胞的收缩功能进行检测，可提供最直接的心脏收缩功能信息，以阐明心脏的病理生理状态或药物对心肌收缩功能的影响。

　　医学实验中心是国内少数能够顺利开展心肌细胞收缩的研究单位之一。心肌细胞收缩和离子测量系统能够通过负载钙敏感性的荧光染料同步检测细胞收缩和细胞内钙离子的变化。其优势在于能够同步获取收缩和钙瞬变的信息，可分析兴奋收缩耦联中肌小节与钙转运的动力学变化过程，还可以进行钙敏感性研究。可用于心衰、基因敲除、心律失常、高血压、药物干预等病理生理药理学研究。

　　系统特色与可开展的研究内容：：

　　1.HyperSwith光源系统可以实现340/380快速转化波长，其比率可达250Hz。最高采样速度达到1000次/秒，可以实现真正的实时测量。高速采集对研究“钙瞬变”快速变化荧光信号有极其重要的意义。

　　2.标配自动灌流给药、程控电刺激系统用于药理学研究。

　　3.可进行Fura-2、Fluo-4、Rhod-2钙敏感性荧光染料负载。

　　4.荧光信号和肌小节长度实时同步检测，进行收缩和钙瞬变同步动力学测量

　　5.心肌细胞收缩与钙瞬变频率依赖性变化

　　6.心肌细胞钙敏感性检测

图５ 中药单体对心肌细胞收缩功能及钙瞬变影响

　　注：单细胞收缩与钙瞬变同步检测，高速采集达250~1000HZ。A， 心肌细胞收缩概览；B， 单细胞收缩曲线；C， 单细胞钙瞬变曲线。

图６ 乌头碱心肌细胞钙敏感性检测：ratio-shortening loop曲线

　　注：曲线的钙消除的下降支的斜率变化反映钙敏感性的变化。当下降支右移或者斜率降低时，钙敏感性减弱，反之增强。

　　三、心肌细胞高通量钙转运检测系统

　　依托设备/软件：

　　1、细胞内离子成像测量系统及心肌细胞收缩测定仪，生产商：IonOptix（美国），型号：HSW400

　　2、快速转换光源，生产商：Sutter（美国），型号：DG4

　　3、EMCCD单光子探测器，生产商：Andor（英国），型号：DU-897D

　　4、快速灌流系统，生产商：ALA（美国），型号：VC3-8

　　5、肌浆网钙转运高通量分析软件，中国中医科学院医学实验中心编译，版本：ClaProV2.0

　　钙瞬变幅度与心肌细胞收缩具有正相关性，同时钙瞬变消除期的消除时间常数反映了NCX外排和SERCA2a回摄入SR的能力，而同时SR Ca2+释放严重依赖于SR Ca2+含量，SERCA2a功能升高将增加SR Ca2+含量，从而增加了Ca2+瞬变振幅，也能稳定胞浆钙离子浓度。当NCX、SERCA2a或RyR功能异常时将导致心肌钙转运异常进而导致收缩功能障碍或心律失常。

　　兴奋收缩耦联的钙转运研究特点：

　　1.   需要细胞处于兴奋收缩状态：成年心室肌细胞不能自主收缩，需要来自窦房结或者电刺激的兴奋冲动

　　2.   需要高的采集频率：大于100HZ，否则不能有效的记录细胞钙离子的变化曲线

　　3.   需要不间断的灌流：①提供营养底物；②切换工具药（多通道灌流满足ms级快速切换） 

　　鉴于钙瞬变、肌浆网钙回摄及钙泄漏等检测都需要同步电刺激、高采集频率及多通道药物灌流，而实验配置的误差会极大的影响实验的精准度，所以长久以来心肌细胞钙转运研究的检测效率及结果稳定性一直困扰从事相关研究的科研人员。机能实验室改进了荧光信号采集方式及优化实验流程实现稳定可靠的高通量心肌细胞钙转运检测。从以往单细胞检测模式升级为多细胞检测以及基于多孔板的高通量检测模式，可实现高效、可靠的兴奋收缩耦联钙转运研究，大幅提高了检测效率、精准性和可重复性。目前可开展如下检测内容：

• 　　高通量钙瞬变（calcium transient）

• 　　肌浆网钙库容量（SR calcium content）

• 　　肌浆网钙ATP酶（SERCA）活性

• 　　钠钙交换体（NCX）活性

• 　　肌浆网钙泄漏（SR leak）

• 　　线粒体钙泵（Mito Ca ATPase）活性

• 　　基膜钙ATP酶（SL Ca ATPase）活性

• 　　钙流检测

• 　　细胞内Na，K，Cl，ROS，NO等检测

图７ 多细胞钙瞬变检测

　　注：能够同时进行多心肌细胞的钙瞬变检测，同时满足高时间和空间分辨率。中药单体对心肌细胞钙瞬变影响。A， 心肌细胞钙荧光；B， 给药前多细胞钙瞬变；C， 给药后多细胞钙瞬变。 

图８肌浆网钙转运检测与原理

　　注：A：肌浆网钙库、SERCA、NCX功能检测；B：肌浆网钙泄漏检测。

　　我们自主编译了用于肌浆网钙转运的高通量分析软件，该转件具有以下特点：

• 　　能够自动对钙瞬变进行分块，定位起始点、峰值

• 　　实现对心肌细胞肌浆网钙转运相关数据降噪、插值、拟合、曲线计算、导出等数据分析。

• 　　对不同类型的钙转运数据进行高通量的数据分析及汇总

• 　　批量导出图像信息，以利于细胞钙转运数据的快速展示

• 　　输出用于第三方软件重新绘图的原始数据及拟合数据。

• 　　所见即所得，输出的图片可以直接用于文章demo图片

肌浆网钙转运高通量分析软件V2.0

　　参考文献：

　　(1) 　Cui T, Liu W, Yu C, Ren J, Li Y, Shi X#, Li Q#, Zhang J#. Protective Effects of Allicin on Acute Myocardial Infarction in Rats via Hydrogen Sulfide-mediated Regulation of Coronary Arterial Vasomotor Function and Myocardial Calcium Transport. Front Pharmacol. 2021. 12: 752244.

　　(2)　Fan J*, Li H*, Xie R*, Zhang X, Nie X, Shi X, Zhan J, Yin Z, Zhao Y, Dai B, Yuan S, Wen Z, Chen C, Wang DW. LncRNA ZNF593-AS Alleviates Contractile Dysfunction in Dilated Cardiomyopathy. Circ Res. 2021. 128(11): 1708-1723.

　　(3) 　Zhang J*, Shi X*, Gao J, et al. Danhong Injection and Trimetazidine Protect Cardiomyocytes and Enhance Calcium Handling after Myocardial Infarction. Evid Based Complement Alternat Med. 2021. 2021: 2480465.

　　(4)　Gao J*, Shi X*, He H, et al. Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes. J Vis Exp. 2017. (127).

　　(5) 　黄聪, 孙明杰, 崔海峰, 孙丽华, 武乾, 翟取, 石晓路#. 基于网络药理学探讨生脉散降低钙泄漏保护糖尿病大鼠心肌收缩功能的机制研究. 药学学报. 2022. 57(10): 3115-3123.